Измерение ферментативной активности. Ферментативная активность

Активность ферментов. Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (МЕ) и катал (кат). За международную единицу активности фермента принято такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моля субстрата за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МЕ). При бимолекулярной реакции A + В = С + D за единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля А или В, или 2 мкмолей А (если В = А), за 1 мин.

Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность – это число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка.

Молекулярная активность (число оборотов фермента) – число молекул субстрата, подвергающееся превращению одной молекулой фермента за 1 мин при полном насыщении фермента субстратом. Она равна числу единиц активности фермента, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Понятие молекулярной активности применимо только для чистых ферментов.

Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активности каталитического центра . Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин в расчете на один активный центр.

Активность ферментов сильно зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0−50°С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования фермент-субстратного комплекса и всех последующих событий катализа. При повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоффа). Однако дальнейшее возрастание температуры (>50°С) сопровождается повышением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом – значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность.

Зависимость активности ферментов от значения рН среды имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды , при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого значения в ту или другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа). При работе с ферментами необходимо поддерживать рН с помощью соответствующего буферного раствора.

Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (веществ, частично или полностью снижающих активность) и активаторов (веществ, увеличивающих активность). Их роль выполняют катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др.

Принципы ферментативной кинетики. Суть кинетических исследований состоит в определении максимальной скорости ферментативной реакции (V max) и константы Михаэлиса К М. Ферментативная кинетика изучает скорости количественных превращений одних веществ в другие под действием ферментов. Скорость ферментативной реакции измеряют по убыли субстрата или приросту образующегося продукта за единицу времени, либо по изменению концентрации одной из смежных форм кофермента.

Влияние концентрации фермента на скорость реакции выражается в следующем: если концентрация субстрата постоянна (при условии избытка субстрата), то скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. Для кинетических исследований используют концентрацию фермента 10  8 М активных центров. Оптимальное значение концентрации фермента определяют из графика зависимости активности фермента от его концентрации. Оптимальным считается значение, лежащее на плато полученного графика в области значений активности фермента, мало зависящих от его концентрации (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Зависимость скорости ферментативной реакции

от концентрации фермента

Для изучения влияния концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции сначала строят кинетическую кривую, отражающую изменение концентрации субстрата (S 1) или продукта (Р 1) во времени (рис. 4.4) и измеряют начальную скорость (V 1) реакции как тангенс угла наклона касательной к кривой в нулевой точке.

Рис. 4.4. Кинетические кривые ферментативной реакции

Построив кинетические кривые для других значений концентрации данного субстрата (S 2 , S 3 , S 4 и т. д.) или продукта (Р 2 , Р 3 , Р 4 и т. д.) и определив начальные скорости (V 2, V 3 , V 4 и т. д.) реакции, строят график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (при постоянной концентрации фермента), который имеет вид гиперболы (рис. 4.5).

Рис. 4.5. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции

от концентрации субстрата

Кинетика многих ферментативных реакций описывается уравнением Михаэлиса  Ментен. При постоянной концентрации фермента и малых значениях концентрации субстрата [S] начальная скорость реакции прямо пропорциональна [S] (рис. 4.5). В этом случае говорят о полунасыщении фермента субстратом, когда половина молекул фермента находится в форме фермент-субстратного комплекса и скорость реакции V = 1/2V max . В отношении субстрата реакция имеет 1-й порядок (скорость реакции прямо пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества) или 2-й порядок (скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ).

При высоких значениях концентрации субстрата [S] скорость реакции почти не зависит от [S]: при дальнейшем увеличении [S] скорость реакции растет все медленнее и в итоге становится постоянной (максимальной) (рис. 4.5). При этом достигается полное насыщение фермента субстратом, когда все молекулы фермента находятся в форме фермент-субстратного комплекса и V = V max . В отношении субстрата реакция имеет 0-й порядок (скорость реакции не зависит от концентрации реагирующих веществ).

В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Согласно этой модели, образование специфического фермент-субстратного комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа.

k 1 k 3

Е + S ⇄ ЕS → Е + Р

Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ЕS-комплекс. Константа скорости этого процесса k 1 . Судьба ЕS-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на фермент Е и субстрат S с константой скорости k 2 , либо подвергнуться дальнейшему превращению, образуя продукт Р и свободный фермент Е, с константой скорости k 3 . При этом постулируется, что продукт реакции не превращается в исходный субстрат. Это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта невелика.

Скорость катализа определяют в стационарных условиях , когда концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрация исходных веществ и конечных продуктов изменяется. Это имеет место в том случае, когда скорость образования ЕS-комплекса равна скорости его распада.

Можно ввести новую константу К М – константу Михаэлиса (моль/л), которая равна

Уравнение Михаэлиса – Ментен , выражающее количественное соотношение между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата, имеет вид

(4.2)

Это уравнение соответствует графику зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата , когда [S] намного ниже К М, V = V max [S] / К М, т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата , когда [S] намного выше К М, V = V max , т. е. скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.

Если [S] = К М, то V = V max /2.

Таким образом, К М равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной .

Константа Михаэлиса (К М) и максимальная скорость реакции (V max) – важные характеристики скорости при разных концентрациях субстрата. V max – величина постоянная для каждого фермента позволяет оценить эффективность его действия.

Константа Михаэлиса показывает сродство субстрата к ферменту (в случае, когда k 2 >> k 3): чем меньше К М, тем больше сродство и выше скорость реакции, и наоборот. Каждый субстрат характеризуется своей величиной К М для данного фермента и по их значениям можно судить о субстратной специфичности фермента. Константа Михаэлиса зависит от природы субстрата, температуры, рН, ионной силы раствора и наличия ингибиторов.

В связи с тем, что определение V max и К М непосредственно из графической зависимости Михаэлиса – Ментен (рис.4.5) является неоднозначным, прибегают к линеаризации данного уравнения. Для этого его преобразуют в такую форму, чтобы графически оно выражалось прямой. Существует несколько методов линеаризации, среди которых наиболее часто применяют методы Лайнуивера – Бэрка и Эди – Хофсти.

Преобразование Лайнуивера – Бэрка имеет вид

(4.3)

Строят график зависимости 1/V = f (1/[S]) и получают прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величину 1/V max ; отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс дает величину −1/К М, а тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс равен К М /V max (рис. 4.6). Этот график позволяет более точно определять V max. Как мы увидим ниже, из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования активности фермента.

Рис. 4.6. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Лайнуиверу – Бэрку)

Метод Эди – Хофсти основан на преобразовании уравнения Михаэлиса – Ментен путем умножения обеих его частей наV max:

(4.4)

График в координатах V иV /[S] представляет собой прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величинуV max, а отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс, – величинуV max /К М (рис. 4.7). Он позволяет очень просто определять К М иV max , а также выявлять возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на предыдущем графике.

Рис. 4.7. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Эди – Хофсти)

Ингибирование активности ферментов. Действие ферментов можно полностью или частично подавить определенными химическими веществами – ингибиторами . По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность связывания ингибитора с ферментом.

Обратимые ингибиторы – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и при их удалении активность фермента восстанавливается. Обратимое ингибирование может быть конкурентным, неконкурентным и бесконкурентным.

Примером конкурентного ингибирования является действие структурных аналогов субстрата, которые могут связываться с активным центром фермента похожим способом, как и субстрат, не превращаясь однако в продукт и препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом, т. е. имеет место конкуренция между субстратом и ингбитором за связывание с активным центром фермента. В результате образования комплексов фермент-ингибитор (EI) концентрация ES-комплексов уменьшается и, как следствие, падает скорость реакции. Иными словами, конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат.

Измерение скоростей реакций при разных концентрациях субстрата позволяет отличать конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике зависимости 1/V =f (1/[S]) прямые пересекают ось ординат в одной точке 1/V max независимо от присутствия ингибитора, но в присутствии ингибитора увеличивается тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, т. е.V max не изменяется, а К М увеличивается, что свидетельствует об уменьшении сродства субстрата к ферменту в присутствии ингибитора (рис. 4.8). Следовательно, при достаточно высокой концентрации субстрата в условиях конкуренции за активный центр фермента, когда субстрат вытесняет ингибитор из активного центра, ингибирование может быть устранено, и скорость катализируемой реакции восстанавливается. При этом уравнение Михаэлиса − Ментен имеет вид

(4.5)

где [I] – концентрация ингибитора; K i – константа ингибирования.

Константа ингибирования характеризует сродство фермента к ингибитору и представляет собой константу диссоциации ЕI-комплекса:

(4.6)

В присутствии конкурентного ингибитора тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс увеличивается на величину (1 + [I]/K i ).

Рис. 4.8. Конкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу − Бэрку

При неконкурентном ингибировании ингибитор отличается по структуре от субстрата и связывается не с активным, а с аллостерическим центром фермента. Это ведет к изменению конформации активного центра фермента, что сопровождается снижением каталитической активности фермента. Причем ингибитор может связываться не только со свободным ферментом (Е + I → EI), но и с фермент-субстратным комплексом (ES + I → ESI). Обе формы EI и ESI не активны. Субстрат и ингибитор могут быть одновременно связаны молекулой фермента, но участки их связывания не перекрываются. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Ингибитор не препятствует образованию ES-комплексов, но тормозит превращение субстрата в продукт. Вследствие этого V max уменьшается, т. е. в присутствии ингибитора пересечение прямой с осью ординат произойдет в более высокой точке (рис. 4.9). В той же мере возрастает и тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, равный К М /V max I . К М в отличие от V max не изменяется, поэтому неконкурентное ингибирование не может быть устранено увеличением концентрации субстрата.

Рис. 4.9. Неконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Максимальная скорость реакции V max I в присутствии неконкурентного ингибитора описывается уравнением

(4.7)

В частном случае бесконкурентного ингибирования , когда ингибитор связывается только с ES-комплексом и не связывается со свободным ферментом, на графике зависимости 1/V = f (1/[S]) прямые параллельны друг другу и пересекают оси ординат и абсцисс в разных точках (рис. 4.10).

Рис. 4.10. Бесконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Необратимые ингибиторы – это высокореакционноспособные соединения различной химической природы, которые могут взаимодействовать с функционально важными группами активного центра, образуя прочные ковалентные связи. Это приводит к безвозвратной потере активности фермента. В связи с этим теория Михаэлиса – Ментен, основанная на предположении, что присоединение ингибитора к ферменту носит обратимый характер, в данном случае неприменима.

Примером необратимого ингибирования служит взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам цистеиновных остатков фермента и образуют при этом меркаптиды – практически недиссоциирующие соединения, либо ковалентная модификация фермента под действием алкилирующих агентов.

1. Особенности ферментативных реакций

2. Влияние температуры на активность ферментов

3. Влияние рН на активность ферментов

4. Активаторы и ингибиторы ферментов

I . Все ферментативные реакции имеют 4 особенности

· Высокая активность ферментов;

· Обратимость действия ферментов;

· Специфичность действия ферментов;

· Лабильность (чувствительность).

Высокая активность ферментов. Ферменты обуславливают высокую скорость ферментативной реакции, которая характеризуется числом оборотов ферментов – это количество молекул субстрата, которое превращается в продукты реакции при действии одной молекулы фермента в единицу времени. Например, алкогольдегидрогеназа имеет активность 4700 ед., фосфорилаза – 50000 ед., a-амилаза – 16000 ед.

Обратимость действия ферментов установил Данилевский. Под обратимостью действия ферментов понимают образование комплекса ES и его распад, т.е. реакции с участием фермента могут идти как в одну сторону (биосинтез), так и в обратную (распад).

Специфичность действия ферментов - каждый фермент действует только на свой определенный субстрат или группу родственных субстратов. Например, инвертаза действует на сахарозу; a-амилаза – только на крахмал и декстрины; протеазы – на белки.

Существует две тачки зрения, объясняющие специфичность действия ферментов. По образному представлению Э. Фишера “фермент подходит к субстрату как ключ к замку”, т.е. топография активного центра фермента не только высокоупорядочена, но и жестко закреплена. Активной центр фермента соответствует топографии только одного единственного субстрата. Вторая точка зрения, предложена Д. Кошландом - теория индуцированного соответствия фермента и субстрата: конформация фермента, в особенности его активного центра, способна к определенным модификациям. В зависимости от конформационной подвижности активного центра фермент способен взаимодействовать либо с немногими, либо с самыми разными субстратами. Иными словами, в момент образования комплекса ЕS, происходят изменения в структуре как фермента, так и субстрата. В результате чего они адаптируются друг к другу.

Специфичность ферментов играет важную роль в процессе обмена веществ в живом организме. (Если бы фермент не имел уникальных свойств, то в живом организме не было бы обмена веществ)

По признаку специфичности ферменты делятся на 2 группы:

· Абсолютная специфичность – фермент действует только на одно-единственное вещество или катализирует только определенное превращение этого вещества;

· Относительная или групповая специфичность – ферменты действуют сразу на многие субстраты, обладающих рядом общих структурных свойств.

Лабильность (чувствительность) – все ферменты чувствительны к повышению температуры и низким значениям рН, при которых происходит потеря активности ферментов.

II . Важнейшим фактором, от которого зависит активность ферментов, является температура.

Графически зависимость скорости ферментативной реакции от температуры выглядит следующим образом:

При 0°С, а тем более при температурах ниже 0°С действие большинства ферментов прекращается. Повышение температуры (кривая 1) выше 0°С способствует увеличению активности ферментов (увеличивается число столкновений реагирующих веществ). При определенной температуре фермент проявляет максимальную активность. Для большинства ферментов оптимальной температурой действия является 40-50°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к инактивации ферментов (уменьшения активности) вследствие термической денатурации белковой молекулы (кривая 2).

Изменение скорости реакции при повышении температуры на каждые 10°С выражают температурным коэффициентом Q 10 . Температурный коэффициент представляет собой отношение скорость реакции при данной температуре v t +10 к скорости реакции при температуре на 10°С ниже данной:

Величина Q 10 для химических реакций лежит в приделах 2-4, для ферментативной реакции – между 1 и 2; Q 10 ферментативных реакции заметно снижается при повышении температуры.

III . Каждый фермент проявляет своё действие в пределах довольно узкой зоны рН. Графическая зависимость активности фермента от рН имеет вид:

В кислой среде, при низких значениях рН, имеет форму ЕН 2 + , в такой форме он малоактивен. При оптимуме рН фермент обладает максимальной активностью и находится в форме ЕН; при подщелачивании среды, фермент приобретает форму Е - .

Оптимальной активности соответствует определенная область рН, причем каждый фермент имеет свое оптимальное значение рН действия (например, бактериальная a-ами-лаза имеет рН оптимум при 6, а a-амилаза микроскопических грибов – 4,7). Оптимальное значение рН связано с аминокислотным составом ферментов.

Колоколообразная форма кривой объяснится с амфотерной природой ферментов; восходящая и нисходящая ветви этой кривой являются типичными кривыми титрования и определяется значениями рК ионных групп, которые находятся в активном центре ферментов.

Для определения функциональных групп, входящих в активный центр фермента, необходимо определить зависимости активности этого фермента от рН при разных температурах и определить значение рК. Зная значения ΔрК для кислой и щелочной ветви зависимости v = f(pH) находят функциональные группы, которые соответствуют этому значению.

IV . Все вещества, сопровождающие фермент в процессе реакции можно подразделит на активаторы, ингибиторы и нейтральные соединения.

Активаторы – химические соединения, повышающие действие ферментов (например, глютатион активизирует действие протеаз, NaCl увеличивает активность амилаз); ингибиторы – соединения, подавляющие их активность (например, группа –CN подавляет активность дыхательных ферментов, находящихся в цитохромной системе) и нейтральные соединения не оказывают никакого влияния на ферменты.

Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым.

Обратимые ингибиторы бывают:

· Конкурентного действия – ингибитор взаимодействует с функциональными группами активного центра ферментов. Ингибирование в данном случае зависит от концентрации субстрата: если [S] велика, то влияние ингибитора [I] может не проявляться; если же [S] мала, то ингибитор может вытеснить субстрат из соединения с ферментом, действие которого при этом затормаживается. Тройной комплекс ЕSI при конкурентном ингибировании никогда не образуется.

· Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор не способен присоединяться к ферменту, не он может связываться с фермент-субстратным комплексом, переводя его в неактивную форму.

· При смешанном ингибировании ингибитор действует как на участок связывания ES, так и на каталитический центр фермента.

Во многих случаях истинное молярное количество фермента неизвестно. Поэтому принято о количестве фермента судить по скорости реакции, которую он катализирует в определенных условиях измерения. Определение активности фермента - это косвенное определение его количества, так как скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации действующего фермента.

По решению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза (1961) за международную единицу активности фермента принимается такое его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в одну минуту при 30°С (мкмоль/мин). Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка или на 1 мг препарата.

Согласно международной системе мер (1972) рекомендована новая международная единица активности фермента - катал. Катал соответствует количеству фермента, способному вызвать превращение 1 моль субстрата в продукт в одну секунду (моль/с).

Отношение прежней единицы активности фермента к ка- талу составляет мкмоль/мин - 60 мкмоль/с - 16,67 нмоль/с. Следовательно, единица активности фермента соответствует 16,67 нкат.

Нормальное функционирование органов и тканей организма является отражением координированного функционирования всех регуляторных систем, включая ферментные. Можно полагать, что изменение активности одного фермента или его отсутствие приводит к нарушению постоянства метаболизма. При любой этиологии болезни, инфекционной или инвазионной, возникают изменения активности ферментных систем, и в этом смысле все болезни рассматриваются как метаболические.

По причине нарушений определенных ферментных систем в организме выявлены многие болезни животных и человека. Так, известны анемии, вызываемые недостатком в эритроцитах пируваткиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, метге- моглобинредуктазы. Часто патогенез патологического процесса нелегко определить. Чтобы выяснить, какая ферментная система нарушена, следует изучить многие факторы; необходима тканевая биопсия, выбор соответствующих диагностических реакций, активаторов или ингибиторов фермента.

Необходимость определения активности сывороточных ферментов основана на предположении, что изменения их активности отражают изменения, происходящие в определенном органе. Можно выявить в сыворотке ферменты двух типов: один является специфическим для сыворотки, выполняя конкретную роль, тогда как другой тип фермента обычно присутствует в сыворотке в очень низкой концентрации и не несет определенной функции.

При ряде патологий (инсульт) возможны изменения клеточной проницаемости и увеличение числа разрушенных клеток, что приводит к выходу внутриклеточных ферментов в плазму. В этих случаях первыми в плазме обнаруживаются ферменты низкой молекулярной массы.

В диагностике патологии отдельного органа было бы идеально определить активность фермента, характерного для данного органа. Однако это невозможно осуществить, поскольку метаболизм в разных органах протекает одинаково. И все же можно установить тканевые или органоспецифические ферменты, активность которых отражает функцию определенных тканей или органов. Например, повышение активности кислой фосфатазы в крови характеризует наличие опухоли простаты; повышение активности лактатдегидрогеназы и креатинфосфо- киназы в сыворотке крови является весьма информативным диагностическим тестом, который отражает повреждение сердечной мышцы. Увеличение активности изоферментов ЛДГ^ и ЛДГ 2 в сыворотке крови указывает на инфаркт миокарда, повышение активности ЛДГ и аспартатаминотрансферазы свидетельствует о распаде клеточных элементов в костном мозге. Связь между активностью ферментов и патологическим процессом не всегда объяснима, но эти данные, несомненно, имеют большой клинический интерес.

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и определить его варианты (так называемые биовары). Рассмотрим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Поэтому эти среды названы "пестрый ряд". Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в "поплавке" на жидких средах. "Поплавок" - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую до стерилизации помещают в пробирку со средой (рис. 18).

Рис. 18. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов. I - "пестрый ряд": а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа; II - колонии микроорганизмов, не разлагающих (бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на среде Эндо - справа)

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны (см. рис. 18).

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеплять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен (рис. 19). Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (см. рис. 19).

Рис. 19. Протеолитические свойства микроорганизмов. 1 - формы разжижения желатина; II - определение сероводорода; III - определение индола: 1 - отрицательный результат; 2 - положительный результат

Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных определенными реактивами (системы индикаторные бумажные "СИБ"). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37° С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эритроциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона (рис. 20). При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

Рис. 20. Гемолиз вокруг колоний, растущих на агаре с кровью

Сохранение культур

Выделенные и изученные культуры (штаммы), представляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4° С, лучше при -30-70° С.

Восстановление высушенных культур. Сильно нагревают кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка * смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампулы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

* (При избытке воды на тампоне она может попасть в ампулу и нарушить стерильность культуры: ее засосет через образовавшиеся микротрещины, так как в ампуле вакуум. )

Внимание! Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылиться находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры можно также в жидком азоте (-196° С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следующие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Между пересевами культуры хранят при 4° С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столбиком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганизмов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хранение при -20-70° С; 4) хранение в запаянных пробирках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Контрольные вопросы

1. Что входит в понятие "бактериологическое исследование"?

2. Какой должна быть культура для такого исследования?

3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?

4. Что входит в понятие "культуральные свойства микробов"?

Задание

1. Изучите и опишите несколько колоний. Пересейте их на скошенный агар и на сектор.

2. Изучите и опишите характер роста - культуры на скошенном агаре. Определите чистоту и морфологию культуры в окрашенном препарате.

3. Пересейте культуру со скошенного агара на бульон и на дифференциально-диагностические среды. Изучите и запишите в протокол характер роста культуры на этих средах и ее ферментативные свойства.